A fixação das amostras (biópsias) é de fundamental importância para a obtenção de bons resultados com a técnica de IHQ. A superfixação pode levar ao mascaramento dos antígenos, contribuindo para a redução da marcação IHQ, já uma fixação pobre pode levar a degeneração do tecido (necrose), resultando em coloração de fundo não específica.

- O tipo do fixador, sua concentração, o tamanho do fragmento de tecido a ser fixado e o tempo de exposição deste ao fixador são extremamente relevantes em IHQ. A fixação de pequenos fragmentos de tecido no menor tempo de - fixação possível é recomendada. A formalina tamponada 10% é o fixador mais utilizado em IHQ. Para este fixador, o ideal é fixar blocos de tecido de 10.0 x 10.0 x 3.0 mm (5-10 mL de formalina tamponada por bloco), por no máximo 24 horas.

- Temperaturas de inclusão em parafina ou desparafinização superiores a 60°C produzem alterações na estrutura do antígeno diminuindo a intensidade da coloração.

- As secções de tecido feitas para IHQ devem ser finas (de 2-4 micrômetros) e coletadas sobre lâminas revestidas com adesivos, como Organosilano com Poli-L-lisina. Devido às várias lavagens e exposição ao calor, os cortes tendem a descolar durante o procedimento de IHQ se não forem utilizadas lâminas revestidas.

- Para a melhor adesão das secções de tecido às lâminas e sua desparafinização, estas devem ser deixadas em estufa - a 60°C, por 1-2 horas. Temperaturas superiores a 60 °C não são recomendadas, podendo agredir demais os tecidos e provocar artefatos de reação.