- A recuperação dos antígenos é uma etapa crucial da técnica IHQ. Falhas nesse procedimento podem acarretar - na total ausência de coloração específica, ou na presença de coloração de fundo inespecífica e artefatos de reação - (enrugamento dos tecidos, descolamento dos tecidos das lâminas, etc.). - É importante que a solução tampão para recuperação antigênica esteja pré-aquecida (Banho-Maria, 95-99oC) - ao se introduzir as lâminas e marcar o tempo de exposição ao calor (este pode variar de 20-40 minutos, no caso - do Banho-Maria ou Panela a Vapor). Observação: a temperatura deve ser aferida diretamente na solução de - recuperação, com um termômetro. No caso da utilização do Banho-Maria ou Panela a Vapor, um orifício pode ser - feito na tampa, permitindo que um termômetro seja introduzido diretamente dentro da cuba contendo a solução - de recuperação. - Não é aconselhável que o tampão de recuperação entre em ebulição durante o aquecimento. Assim, em localidades - onde a água entre em ebulição a 98 oC, devido à pressão atmosférica, o usuário deverá fazer verificar e ajustar a - temperatura ideal a ser utilizada para a recuperação as suas condições. - Após exposição ao calor, a cuba contendo as lâminas imersas na solução de recuperação antigênica deve ser retirada - do Banho-Maria ou Panela a Vapor e colocada para resfriar a temperatura ambiente por 20 minutos. - Observação: este período de resfriamento das lâminas em contato com a solução faz parte do processo de recuperação - antigênica, portanto devendo ser sempre obedecido. - Evite utilizar um único protocolo de recuperação antigênica para todos os anticorpos. Alguns requerem digestão - com enzimas proteolíticas, como a Proteinase K Dako, código S 3020, outros recuperação por calor em tampão - citrato, pH 6.0, ou tampão Tris modificado, pH 9.0, como a Solução de Recuperação Dako, pH alto, código S 3307. - Observação: As bulas dos anticorpos primários Dako trazem sempre indicações sobre a melhor forma de recuperação - antigênica, além da faixa de diluição para o anticorpo, possíveis sistemas de visualização e controles positivos - e negativos. |